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常用来测定蛋白质含量的方法有哪些,优缺点是什么?-捕鱼游戏高爆版

 ①凯氏定氮法


  原理:蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热,蛋白氮转化为铵盐,在强碱性条件下将氨蒸出,用加有指示剂的硼酸吸收,最后用标准酸滴定硼酸,通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。

  

 ②双缩脲法



  原理:尿素在180℃下脱氨生成双缩脲,在碱性溶液中双缩脲可与cu2 形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键,故多肽、蛋白质等都有双缩脲(biuret)反应,产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
  缺点:灵敏度低,样品必须可溶,在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg),且会受样品中 硫酸铵 及 tris 的干扰,但 准确度 较高,不受蛋白质的种类影响。

 

 ③folin酚法(lowry)



  folin酚法是biuret 法的延伸,所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂(碱性铜试剂),试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
  在碱性条件下,蛋白质中的巯基和酚基等可将cu2 还原成cu , cu 能定量地与folin-酚试剂反应生成蓝色物质,600nm比色测定蛋白质含量。
  灵敏度较高(约 0.1 mg),但较麻烦,也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合,要特别注意均匀澈底,否则会有大误差。

 

 ④紫外法



  280nm光吸收法:利用tyr在280nm在吸收进行测定。
  280nm-260nm的吸收差法:若样品液中有少量核酸共存按下式计算:
  蛋白质浓度(mg/ml)=1.24e280-0.74e260 (280 260为角标)

 

 ⑤色素结合法(bradford 法)



  直接测定法:利用蛋白质与色素分子(coomassie brilliant blue g-250)结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
  考马斯亮兰(cbg)染色法测定蛋白质含量。cbg 有点像指示剂,会在不同的酸碱度下变色;在酸性下是茶色,在中性下为蓝色。当 cbg接到蛋白质上去的时候,因为蛋白质会提供 cbg一个较为中性的环境,因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多,吸到蛋白质上的cbg也多,蓝色也会增强。因此,蓝色的呈色强度,是与样本中的蛋白质量成正比。
  间接测定法:蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素,以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。

 

 ⑥bca法



  bca(bicinchoninc acid procedure,4,4’-二羧-2,2’-二喹啉)法与lowry法相似,主要差别在碱性溶液中,蛋白质使cu2 转变cu 后,进一步以bca 取代folin试剂与cu 结合产生深紫色,在波长562 nm有强的吸收。
  它的优点在于碱性溶液中bca 比folin试剂稳定,因此bca与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度lowry法相似。
  本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度,较不受干扰,但会受还原糖 及edta的干扰。

 

 ⑦胶体金测定法



  胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶,呈洋红色,具有高电子密度,并能与多种生物大分子结合。
  胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色,颜色的改变与蛋白质有定量关系,可用于蛋白质的定量测定。

 

 ⑧其他方法



  有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团,如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团,可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉),则可追踪该金属。
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